400-0532-025
時(shí)間：2016-07-22來源：飛測生物點(diǎn)擊量：
摘要：對上海飛測生物科技有限公司研發(fā)生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條在糧食谷物飼料中的檢測性能進(jìn)行了評估。該產(chǎn)品的最低檢出限（LOD）為0.29μg/kg，最低定量限(LOQ)為0.91μg/kg，線性范圍為1.00-50.00μg/kg，線性范圍內(nèi)的添加回收率為92.89%~121.07%，3次重復(fù)的變異系數(shù)在14.56%以內(nèi)。與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均小于5%。該產(chǎn)品具有操作簡便、靈敏準(zhǔn)確、快速定量、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)，適合用于對糧食谷物飼料中黃曲霉毒素B1的進(jìn)行快速定量測定。
關(guān)鍵詞：黃曲霉毒素B1檢測試紙條；熒光定量免疫層析；黃曲霉毒素B1；糧食谷物飼料
黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1簡寫為AFB1）是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌铮幸粋€(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀?/span>，具有強(qiáng)致癌性以及劇毒性，是迄今發(fā)現(xiàn)的各種真菌毒素中最穩(wěn)定的一種。從1993年開始黃曲霉毒素被認(rèn)定為世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定的一類致癌物，是世界公認(rèn)的三大強(qiáng)致癌物質(zhì)之一，而黃曲霉毒素B1由于毒性最大，污染最重，是危害最大的一種黃曲霉毒素。
黃曲霉毒素B1污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麥、花生油等糧油食品，且以南方高溫、高濕地區(qū)受污染最為嚴(yán)重。目前，GB 2761-2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中對糧食谷物及其制品中黃曲霉毒素B1的最高限量為20μg/kg。GB13078-2001《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中對不同種類的飼料中黃曲霉毒素B1的最高限量標(biāo)準(zhǔn)從10-50μg/kg。
目前，國標(biāo)法測定黃曲霉毒素B1采用HPLC法，需要大型的儀器設(shè)備，價(jià)格昂貴，操作過程復(fù)雜、時(shí)間較長，且無法在現(xiàn)場和基礎(chǔ)小型實(shí)驗(yàn)室使用。除此之外，也有采用黃曲霉毒素酶聯(lián)免疫試劑盒或膠體金快速檢測試紙條用于大量樣品的篩查，操作簡便，檢測快速，成本也較低，但準(zhǔn)確性和重復(fù)性較差，容易造成假陽性或者假陰性。因此，急需一種既簡便快速，又能準(zhǔn)確定量的檢測方法，熒光定量免疫層析正好可以滿足這種需求。本文通過對多種糧食谷物飼料樣品的實(shí)測，驗(yàn)證了上海飛測生物開發(fā)的黃曲霉毒素B1熒光定量快速檢測試紙條的技術(shù)性能。
1實(shí)驗(yàn)材料和方法
1.1試劑和材料
除注明外，均為分析純，試驗(yàn)用水均為UP水。
黃曲霉毒素B1熒光熒光定量檢測試紙條（由包被有熒光微球標(biāo)記黃曲霉毒素B1抗體的乳膠墊、噴涂有黃曲霉毒素B1抗原的檢測線和噴涂有羊抗雞二抗的控制線的NC膜、樣品墊及吸收墊組成）、樣品提取液、樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)曲線ID卡及標(biāo)準(zhǔn)曲線條形碼均由上海飛測生物科技有限公司提供。
黃曲霉毒素B1及其他真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品：購自Sigma公司；
大米、玉米、小麥、面粉等樣品從超市購得或從企業(yè)取樣。
麩皮，小麥、面粉等飼料樣品從飼料廠和企業(yè)取樣。
1.2儀器與設(shè)備
FD-100型熒光免疫定量分析儀和FD-5000型試紙條恒溫孵育器，上海飛測生物科技有限公司提供；低速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；漩渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；電子天平：Sartorius；
1.3試驗(yàn)方法
1.3.1樣品的前處理
取具有代表性的待測樣品500g，用小型粉碎機(jī)粉碎1min后過20目篩，收集過篩的細(xì)小樣品。稱取1.0±0.02g過篩的樣品于10mL離心管中，加入5mL提取液，用漩渦混勻儀震蕩5min(或者搖床振蕩10min）后，4000RPM離心1min，取上清。
1.3.2檢測過程
取50μL離心上清液加入500μL樣品稀釋液中，用漩渦混勻器混勻3-5s，然后取100μL加入到黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條的加樣孔中，置于37℃恒溫孵育器中溫育10min后，將試紙條插入熒光免疫定量分析儀中讀數(shù)，即為樣品的實(shí)際檢測濃度。當(dāng)檢測值大于50μg/kg時(shí)，可用提取液將離心上清液稀釋5倍后再進(jìn)行檢測，所得讀數(shù)值乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為最終的檢驗(yàn)結(jié)果。
2檢測結(jié)果分析
2.1線性范圍與檢出限
在樣品提取液中，分別添加1.00μg/kg、2.50μg/kg、5.00μg/kg、10.00μg/kg、25.00μg/kg、50.00μg/kg 的黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，用上海飛測生物黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條每個(gè)樣品檢測3次，以添加濃度為為縱坐標(biāo)，以熒光定量檢測試紙條的檢測結(jié)果為橫坐標(biāo)，擬合曲線并計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如下：
圖1 黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品添加與熒光定量試紙條檢測值的線性關(guān)系
計(jì)算得出小麥的線性范圍：1.00～50.00μg/kg（6點(diǎn)）， 回歸方程: y = 1.042x + 0.540,相關(guān)系數(shù)R2 = 0.998；（見圖1）。
取10個(gè)無污染（陰性）小麥樣品、10個(gè)無污染（陰性）玉米樣品和10個(gè)無污染（陰性）大米樣品，用上海飛測生物黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條每個(gè)樣品檢測3次，檢測限（LOD）為測定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，定量限(LOQ)為測定平均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。測試結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條的LOD為0.29μg/kg，LOQ為0.91μg/kg。
2.2準(zhǔn)確性和重復(fù)性分析
在用國標(biāo)法測定為0的不同種類空白樣品中分別添加黃曲霉毒素B1濃度為1.00，2.50，5.00，10.00，25.00，50.00μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)品，然后按照黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條的檢測方法進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果見表1。
表1 不同樣本檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性
|
樣品 |
黃曲霉毒素B1添加量（μg/kg） |
||||||
|
平行實(shí)驗(yàn) |
1.00 |
2.50 |
5.00 |
10.00 |
25.00 |
50.00 |
|
|
大米 |
1 |
1.23 |
2.21 |
5.04 |
11.91 |
22.86 |
48.89 |
|
2 |
1.17 |
2.67 |
4.96 |
9.78 |
25.12 |
49.99 |
|
|
3 |
0.99 |
2.86 |
4.72 |
9.89 |
24.37 |
46.72 |
|
|
平均值（μg/kg） |
1.13 |
2.58 |
4.91 |
10.53 |
24.12 |
48.53 |
|
|
平均回收率 |
112.83% |
103.20% |
98.14% |
105.27% |
96.47% |
97.07% |
|
|
變異系數(shù)CV |
10.96% |
12.95% |
3.34% |
11.37% |
4.77% |
3.42% |
|
|
玉米 |
1 |
0.987 |
2.38 |
4.383 |
9.876 |
25.098 |
54.987 |
|
2 |
1.09 |
2.89 |
4.98 |
11.287 |
26.341 |
57.01 |
|
|
3 |
0.931 |
2.87 |
4.57 |
10.659 |
28.497 |
55.698 |
|
|
平均值（μg/kg） |
1.00 |
2.71 |
4.64 |
10.61 |
26.65 |
55.90 |
|
|
平均回收率 |
100.27% |
108.53% |
92.89% |
106.07% |
106.58% |
111.80% |
|
|
變異系數(shù)CV |
8.04% |
10.65% |
6.57% |
6.66% |
6.45% |
1.84% |
|
|
小麥 |
1 |
1.345 |
2.84 |
5.004 |
9.884 |
23.78 |
47.123 |
|
2 |
1.276 |
2.65 |
5.418 |
11.583 |
22.461 |
49.045 |
|
|
3 |
1.011 |
2.31 |
4.88 |
10.72 |
24.189 |
49.276 |
|
|
平均值（μg/kg） |
1.21 |
2.60 |
5.10 |
10.73 |
23.48 |
48.48 |
|
|
平均回收率 |
121.07% |
104.00% |
102.01% |
107.29% |
93.91% |
96.96% |
|
|
變異系數(shù)CV |
14.56% |
10.33% |
5.52% |
7.92% |
3.85% |
2.44% |
|
從表1可以看出，上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條測試不同糧食谷物中黃曲霉毒素B1的添加回收率在92.89%~121.07%，3次重復(fù)的變異系數(shù)在14.56%以內(nèi)。
2.3與色譜方法的對比試驗(yàn)結(jié)果
取大米、小麥、玉米、高粱、花生、麩皮、噴漿玉米、DDGS、豆粕受污染樣品各1份，先采用國標(biāo)液相色譜法進(jìn)行測定，再使用上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條進(jìn)行測定，各測試3個(gè)平行樣。檢測結(jié)果如下：
表3 黃曲霉毒素B1熒光定量檢測卡與高效液相色譜法檢測值對比
|
樣本 |
大米 |
小麥 |
玉米 |
高粱 |
花生 |
麩皮 |
噴漿玉米 |
DDGS |
豆粕 |
|
|
色譜值 |
9.87 |
3.98 |
16.38 |
7.73 |
45.87 |
27.21 |
34.62 |
14.87 |
2.75 |
|
|
飛測生物值 |
1 |
10.73 |
4.52 |
17.83 |
6.76 |
44.54 |
30.13 |
32.87 |
12.73 |
2.32 |
|
2 |
9.54 |
4.66 |
18.54 |
6.9 |
47.81 |
28.76 |
31.96 |
13.39 |
2.81 |
|
|
3 |
9.42 |
4.27 |
15.99 |
7.51 |
49.82 |
26.52 |
33.63 |
13.98 |
2.42 |
|
|
平均值 |
9.90 |
4.48 |
17.45 |
7.06 |
47.39 |
28.47 |
32.82 |
13.37 |
2.52 |
|
|
符合度 |
100.27% |
112.65% |
106.55% |
91.29% |
103.31% |
104.63% |
94.80% |
89.89% |
91.52 |
|
|
CV |
7.32% |
4.41% |
7.54% |
5.65% |
5.62% |
6.40% |
2.55% |
4.68% |
10.29% |
|
表2表明，在不同的糧食谷物飼料中，上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條與液相色譜法的符合率為89.89%~112.65%，3次重復(fù)測定的的CV值在10.29%以內(nèi)。
2.4方法特異性
選擇其他5種常見的真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品在陰性玉米中進(jìn)行添加，添加的濃度為100 μg/kg，然后用飛測生物黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條進(jìn)行測試，每個(gè)樣品測3次取平均值；結(jié)果顯示與赭曲霉毒素A，伏馬菌素B1，嘔吐毒素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮交叉反應(yīng)率均＜5%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃曲霉毒素B1膠體金試劑條對伏馬毒素、赭曲霉毒素、黃曲霉毒素、玉米赤霉毒素幾乎無交叉反應(yīng)，其方法特異性可以能滿足檢測要求。
表3 交叉反應(yīng)率表
|
序號 |
名稱 |
測定值 |
交叉反應(yīng)率 |
|
1 |
黃曲霉毒素B1（DON） |
105 |
100.00% |
|
2 |
赭曲霉毒素A (OTA) |
2.32 |
2.32% |
|
3 |
伏馬菌素B1（FB1） |
3.76 |
3.76% |
|
4 |
黃曲霉毒素B1(AFB1) |
2.68 |
2.68% |
|
5 |
玉米赤霉烯酮(ZEN) |
2.71 |
2.71% |
|
6 |
T-2毒素(T-2) |
1.33 |
1.33% |
3結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)采用上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的黃曲霉毒素B1熒光定量檢測試紙條對不同的糧食谷物飼料樣本進(jìn)行測試，該產(chǎn)品的最低檢出限（LOD）為0.29μg/kg，最低定量限(LOQ)為0.91μg/kg，線性范圍為1.00-50.00μg/kg，線性范圍內(nèi)的添加回收率為92.89%~121.07%，3次重復(fù)的變異系數(shù)在14.56%以內(nèi)。與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均小于5%。其準(zhǔn)確性和可靠性均可以滿足歐盟和我國對黃曲霉毒素B1的分析標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求。該方法具有簡便快速、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好等特點(diǎn)，可用于不同糧食谷物飼料中黃曲霉毒素B1的快速定量檢測分析。
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