在當今社會，食品安全受到人們的非常的關(guān)注和重視，尤其發(fā)生了三聚氰胺和地溝油等一系列的事件之后，人們更加的重視食品的安全問題。黃曲霉毒素這類真菌在世界不同地區(qū)都發(fā)現(xiàn)大量存在于食品中，它主要是由黃曲霉和寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的一類有毒次生代謝物［1–2］。目前已知的黃曲霉毒素及其衍生物有 20 余種 , 即 B1，B2，B2a，G1，G2，G2a，M1，M2 等，黃曲霉毒素 B1 是其中毒性最大的一種，實驗結(jié)果顯示，其毒性是人們熟知的劇毒藥氰化鉀的 10 倍，是砒霜的 68 倍。黃曲霉毒素 B1 可誘發(fā)癌癥和皮下肉瘤，并且可使動物的肝、腎、大腦和神經(jīng)系統(tǒng)等產(chǎn)生病變。自 20 世紀 60年代以來，有關(guān)黃曲霉毒素的危害被大量報道，以致黃曲霉毒素已成為最受人們關(guān)注的一種真菌毒素［3］。因此，尋求準確、快速、簡便、價廉的檢測方法，對黃曲霉毒素進行高效的定性定量分析，是黃曲霉毒素研究的一個重要方面。以下對黃曲霉毒素的檢測方法研究進展進行評述。
1、薄層色譜法
1.1薄層層析（TLC）法
TLC 法是測定黃曲霉毒素的經(jīng)典方法，在薄層板展開后，在 365 nm 紫外燈下，黃曲霉毒素 B1，B2，G1 和 G2 分別顯示紫色、藍紫色、綠色和綠色熒光。TLC 法的特異性較差，靈敏度相對較差，且測定黃曲霉毒素專一性不夠，經(jīng)常引起測量誤差。但由于此法設(shè)備簡單，易于普及，所以國內(nèi)外仍在使用。
1.2高效薄層（HPTLC）法
HPTLC 法［4–5］測定黃曲霉毒素采用目前國際上流行的樣品處理方法——固相萃取法（SPE）中針對真菌和病毒的多功能凈化（MFC）柱。采用 MFC 柱凈化后，僅用單相展開即可達到分離測定的目的，不僅節(jié)省了工作時間，提高了工作效率，而且進一步減少了有毒有害溶劑的用量。Stroka 等［6］將免疫親合柱凈化應(yīng)用于 TLC 法測定，進行單相展開并用熒光密度計定量，此方法能檢測含量明顯低于當前歐盟標準的黃曲霉毒素。Kamimura 等［7］用HPTLC 方法測定玉米、花生、蕎麥等樣品，并與通過公職分析化學(xué)家協(xié)會（AOAC）認證的分析花生及花生制品中黃曲霉素的官方方法 CB（Contamination Branch）法和 BF（Best Foods）法進行比較，4 種主要黃曲霉毒素的檢測限均不高于 0.2 μg／kg，回收率與 CB 法一樣均高于 BF 法。
1.3高壓薄層色譜（OPTLC）法
高壓薄層色譜于 1979 年由 Tyihak 提出［8］，它結(jié)合了經(jīng)典薄層色譜法、高效薄層色譜法與高效液相色譜法的優(yōu)點，是一種能夠提高薄層分離效率的平面液相色譜技術(shù)。隨著實驗技術(shù)的不斷成熟，OPTLC 法在飼料和食物中黃曲霉毒素的檢測方面的應(yīng)用越來越多。Eszter Papp 等［9］發(fā)展了一系列適合檢測玉米和小麥中黃曲霉毒素的 OPTLC 方法。
2、高效液相色譜（HPLC）法
由于具有穩(wěn)定、準確、靈敏等優(yōu)點，HPLC 法已成為當前進行黃曲霉毒素定量研究的首選方法。分析黃曲霉毒素的液相色譜方法包括正相液相色譜方法（NPLC）和反相液相色譜方法（RPLC）。反相高效液相色譜 (RP－HPLC) 系統(tǒng)易操作，流動相具有低毒性，可同時分離、分析樣品中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2且不受樣品沸點、熱穩(wěn)定性、和分子量限制，所以目前使用熒光檢測器的反相HPLC 法已經(jīng)成為檢測黃曲霉毒素的主要測定方法［10］。

Chiavaro 等［11］根據(jù)不同環(huán)式糊精增強黃曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1 熒光釋放的不同效果，發(fā)展了將環(huán)式糊精加入到流動相中的高效液相色譜法，黃曲霉毒素 B1，B2，G1，G2 的檢測限均在 0.3 μg／kg 以下，M1 的檢測限在 0.000 5 
μg／kg 以下，幾種黃曲霉毒素都呈線性反應(yīng)關(guān)系。這種方法也被用于測定自然污染及人工添加樣品。
3、免疫學(xué)方法
黃曲霉毒素的免疫學(xué)檢測方法是將生物大分子的免疫學(xué)特性與化學(xué)特性結(jié)合起來的檢測方法。該方法具有快速、靈敏、對樣品純度要求不高的特點，特別適合于大批量樣本的檢測。用于檢測黃曲霉毒素的免疫學(xué)方法有酶聯(lián)免疫吸附測定法、放射免疫測定法、親和層析法、熒光偏振免疫測定法及免疫層析法。
3.1酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA) 法
ELISA 法是在免疫學(xué)和細胞工程學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展出來的一種微量檢測技術(shù)，分為直接法、間接法、雙抗體夾心法和競爭法，其優(yōu)點是對黃曲霉毒素 B1 的檢測定性定量準確而且檢測速度快（比薄層法提高了近 200 倍）［12］，特異性強，熒光物質(zhì)、色素、結(jié)構(gòu)類似物對結(jié)果無干擾，回收率高，提取方法簡單，成本較低，特別適合于對黃曲霉毒素 Bl 污染監(jiān)測控制中大量樣品的篩查［13–14］。缺點是 ELISA 法中酶的活性易受反應(yīng)條件影響，測定結(jié)果重復(fù)性較差，測定結(jié)果易出現(xiàn)假陽性問題；此外 ELISA 試劑壽命短，需要低溫保存，葡萄酒類、含鹽量高的醬油、含脂量高的花生油在提取時要進行調(diào)節(jié)pH 值、脫鹽、脫脂等特殊處理。
3.2親和層析法
親和層析法利用免疫化學(xué)反應(yīng)原理，采用大劑量的單克隆抗體，選擇性吸附提取液中的抗原物質(zhì)黃曲霉毒素。由于抗原 – 抗體反應(yīng)具有高靈敏、高選擇、高特異性等特點，從而大大提高了試樣的凈化效果及檢測靈敏度，同時可顯著減少有毒有害試劑的使用，有利于操作人員的身體健康和環(huán)境保護。
3.3放射免疫 (RIA) 法
RIA 法與 ELISA 法基本相似，不同的是它們所使用的標記物不同，ELISA 法的標記物為酶，RIA 法所用的標記物一般為放射性元素氚 (3H)。該方法是將毒素 –3H 標記物與樣品加抗體進行競爭性結(jié)合，除去未結(jié)合的部分，測定其放射性，放射性強則說明樣品中毒素含量低，反之毒素含量高［15］。實驗證明 ELISA 比 RIA 靈敏度更高且更簡便，并且RIA 需要特殊設(shè)備，有放射性元素污染問題，人員需要安全防護，現(xiàn)在已經(jīng)很少使用。
3.4熒光偏振免疫測定法
熒光偏振免疫測定法的主要原理是熒光標記的毒素在樣品緩沖液中與未熒光標記的毒素對特異性抗體的競爭性結(jié)合。分子質(zhì)量越大，分子旋轉(zhuǎn)速度越慢，熒光偏振值越大。Nasir 等［16］報道了用基于熒光偏振的裝置檢測不同谷物中的黃曲霉毒素。
3.5免疫層析（IC）法
IC 法是 20 世紀 80 年代初發(fā)展起來的一種快速免疫分析技術(shù)，其操作簡單，快速，人員不用培訓(xùn)，且不需特殊的儀器設(shè)備，非常適用于現(xiàn)場測試和進行大量樣品的初篩［17］。
4、免疫學(xué)與儀器結(jié)合方法
近年來，隨著黃曲霉毒素在食品中的檢出標準越來越嚴格，很多人采取了免疫學(xué)與儀器結(jié)合的方法來檢測黃曲霉毒素，發(fā)展了黃曲霉毒素的檢測方法。
4.1免疫親和柱凈化熒光光度法
張藝兵等［18］提出了一種以免疫親和柱凈化結(jié)合熒光光度法檢測黃曲霉毒素的新方法，此法利用抗原抗體——對應(yīng)的特異吸附特性，以黃曲霉毒素單克隆抗體為填充柱，特異性、選擇性地吸附黃曲霉毒素，再以甲醇為流動相將結(jié)合的黃曲霉毒素洗脫下來然后通過溴溶液衍生，所得衍生物可發(fā)射熒光，再通過熒光光度計分析即可以測定毒素含量。此方法克服了 TLC 法和 HPLC 法在操作過程中使用劇毒的真菌毒素作為標定標準物和在樣品預(yù)處理過程中使用多種有毒、有異味的有機溶劑對操作人員造成身體傷害和污染環(huán)境的缺點，所需儀器設(shè)備輕便易攜帶，自動化程度高，操作簡單，靈敏度可達 1 μg／kg，回收率在 85％以上。一個樣品只需10～15 min 便能直接讀出測試結(jié)果，比傳統(tǒng)方法快幾個小時甚至幾天時間。缺點是此法只能測定黃曲霉毒素的總量且對試劑要求比較高，檢測中藥材黃曲霉毒素的含量時結(jié)果會出現(xiàn)一些假陽性。
4.2免疫親和柱高效液相色譜法
免疫親和柱（IAC）是將特異性的黃曲霉毒素單克隆抗體與載體蛋白偶聯(lián)并填柱而成。由于抗原抗體有一一對應(yīng)的特異性吸附關(guān)系，所以 IAC 能特效性地、高選擇性地吸附黃曲霉毒素，而讓其它雜質(zhì)通過柱子，使樣品得以純化，吸附的黃曲霉毒素可以被極性有機溶劑洗脫，再用 HPLC 法進行定量檢測［19］，其優(yōu)點是具有高度特異性，可除去絕大多數(shù)干擾物質(zhì)，檢測限達 1 ng／g，還具有快速、溶劑使用少、可以自動化和再生利用的特點。缺點是柱成本高，商品化 IAC 僅適合幾種毒素，有時需要加預(yù)柱凈化。
4.3多功能凈化柱高效液相色譜法
Wilson 和 Romer［20］開發(fā)了獨特的真菌毒素多功能凈化 (MFC) 柱，MFC 柱提供一種快速的一步萃取純化方法，工作原理和操作過程與其它凈化柱相反，它含有親脂性 ( 非極性 ) 和電荷活性成分 ( 極性 )，當樣品提取液通過柱時，MFC柱保留樣品液中的干擾物質(zhì)如脂肪、蛋白質(zhì)類化合物和碳水化合物等，而待測組分黃曲霉毒素不被吸附而直接通過，從而一步完成凈化過程，除去 90％的雜質(zhì)，減少了傳統(tǒng)凈化方式淋洗雜質(zhì)和洗脫待測樣品的步驟，從而達到凈化目的，這一點是 IAC 和普通 SPE 凈化柱所不具備的，并且與 IAC 相比凈化效果同樣理想，回收率高，靈敏度高，檢測限低。
5、超光譜（HS）法
一直以來，黃曲霉毒素的檢測都用化學(xué)方法，并且有些化學(xué)方法的檢測結(jié)果非常準確，但是化學(xué)方法都要耗費大量的檢測時間，檢測費用較高且損壞檢測樣品，所以研究一種快速、準確、無損樣品的檢測方法對糧食產(chǎn)業(yè)是至關(guān)重要的，超光譜法檢測黃曲霉毒就是這樣一種方法。它的原理是首先通過光源激發(fā)待測樣品，再通過設(shè)備捕捉成像，然后對成像進行特征抽取和特征排列，最后實現(xiàn)區(qū)別受黃曲霉毒素污染和未受黃曲霉毒素污染的樣品。
Haibo Yao［21］等利用超光譜法分析了長波紫外線激發(fā)下的玉米粒的光譜 BGYF 響應(yīng)，首先用中心激發(fā)波長為 365 nm 的紫外線光照射檢測樣品，被檢測到黃綠色熒光的玉米粒，手動挑選出來，結(jié)果顯示，在 500～515 nm 波長范圍具有較強的黃綠色熒光發(fā)射光譜峰，選取 500～515 nm 有較強黃綠色熒光的玉米粒作為陽性組，用高效液相色譜法測定，與正常組對比，呈黃綠色熒光成像的黃曲霉毒素濃度的平均水平濃度是 5.114 μg／g。這個實驗證明了玉米只有在感染黃曲霉毒素多的時候才會發(fā)出黃綠色熒光，所以根據(jù) BGYF 測量黃曲霉毒素的含量是不準確的。
Haibo Yao 等［22］還發(fā)現(xiàn)感染黃曲霉毒素的玉米會發(fā)生峰偏移現(xiàn)象，受黃曲霉毒素感染高的玉米粒其光譜峰會向長波方向移動，未受感染或者感染率低的玉米粒光譜峰會向短波方向移動，并且受黃曲霉毒素感染高的玉米粒比未受感染的玉米粒光譜峰強度低。使用超光譜法和光譜角度映射分類法對樣品測試，樣品熒光強度不敏感但對峰的變化敏感［23］，對待測玉米以 20，100 ng／g 為臨界值做檢測，分類精度為 86％時有 15％的假陽性率，88％時有 16％的假陽性率，結(jié)果表明，超光譜法和光譜角度映射分類法可以對感染與非感染玉米進行分類。
Haibo Yao 等［24］用中心波長為 365 nm 的紫外光激發(fā)待測玉米，用最大相似率和二進制編碼兩種算法分別對臨界值為20，100 ng／g 進行實驗，并與 HPLC 檢測結(jié)果進行對比，發(fā)現(xiàn)二進制編碼比最大相似率分類精確，20 ng／g 和 100 ng／g 的分類精度分別為 87%，88%。
Pearson 等［25］發(fā)現(xiàn)在 BGYF 光很弱的時候利用該檢測系統(tǒng)無法檢測到 BGYF。他用一個硅光電二極管光纖光譜儀通過辨別分析，利用光的反射比從含量小于 10 ng／g 或者沒有被污染的玉米中檢測出受黃曲霉毒素污染大于 100 ng／g 的玉米，分類精度達到 96.6%。
Kalkan 等［26］在 365 nm 的紫外燈下分析了 285 個榛子樣品，在 440～450 nm 該鑒別能力最強的譜帶分類精度達到 90%。Musa Ata 等［27］用超光譜法對紅辣椒進行實驗，選擇鹵素?zé)艉妥贤夤鈨煞N光源進行對比，在對成像進行特征抽取時分為單獨頻帶能量特征和連續(xù)絕對差異光譜波段能量兩種，在成像的特征排列中用了最低冗余和最大相關(guān)性（mRMR）及多層感知器連接權(quán)重（MLP），并對單獨頻帶能量特征和連續(xù)差異光譜波段能量使用了量子直方圖矩陣方法，并與 HPLC 檢測結(jié)果做了對比，最終實驗結(jié)果表明光源采用鹵素?zé)簟⑻卣髋帕蟹椒ú捎肕LP 法的分類精度最高（達 91%）。Haibo Yao 等［28］研究了窄頻帶光譜指數(shù)加速檢測黃曲霉毒素的方法，原先因為受到發(fā)射響應(yīng)的限制，成像的強度位準比較低，全部的檢測結(jié)果持續(xù)時間很長，而窄頻帶光譜可以使這種情況得到改善。首先用歸一化差異熒光指數(shù)（NDFI）、差異化指數(shù)（DFI）、熒光率指數(shù)（FRI）3 個指數(shù)與多譜線成像系統(tǒng)進行比較，發(fā)現(xiàn)兩個系統(tǒng)的 NDFI 指數(shù)有最好的相關(guān)性，然后用窄頻帶光譜對25 g 和 1 kg 的樣品分別做了臨界值為 20，100 ng／g 的實驗，并與 HPLC 進行比較。25 g 樣品 20，100 ng／g 的分類精度為 83.33%，85.26% ；1 kg 樣品 20，100 ng／g 的分類精度為69.23%，95.73%。6針對黃曲霉毒素 B1 的快速檢測方法因為黃曲霉毒素 B1 是黃曲霉毒素中毒性最強的，所以隨著對黃曲霉毒素研究的深入，產(chǎn)生了很多對其快速檢測的方法。
6.1免疫親和微柱檢測法
免疫親和微柱檢測法的原理是試樣提取液經(jīng)過濾、稀釋后，通過黃曲霉毒素 B1 免疫親和柱。黃曲霉毒素 B1 免疫親和柱是由偶聯(lián)有黃曲霉毒素 B1 抗體的免疫親和微球填充而成的，而此抗體對黃曲霉毒素 B1 具有專一性，樣液中黃曲霉毒素 B1 被抗體捕獲，雜質(zhì)隨洗滌液流出微柱，再以甲醇將黃曲霉毒素 B1 洗脫，洗脫液采用熒光光度法根據(jù)黃曲霉毒素 B1 檢測工作曲線測定黃曲霉毒素 B1 的含量。朱劍［29］等用免疫親和微柱法對大米，油脂，玉米粉做了黃曲霉毒素的檢測并與酶聯(lián)免疫吸附法作了比較，發(fā)現(xiàn)兩種檢測方法的準確度和靈敏度都比較高，免疫親和微柱法比ELISA 的重復(fù)性好，對植物油中黃曲霉毒素 B1 含量檢測結(jié)果準確可靠。ELISA 一次可以檢測多個樣本，適于大批量樣 黃潔：黃曲霉毒素檢測方法研究進展 103品快速篩選，免疫親和微柱法一次只能檢測一個樣本，適于單一樣品現(xiàn)場快速檢測，都比較適合基層實驗室推廣使用。
6.2一步式金標試紙法
金標免疫層析 (GICA) 是 20 世紀 80 年代初發(fā)展起來的一種快速免疫診斷技術(shù)。一步式黃曲霉毒素檢測金標試紙法是利用單克隆抗體而設(shè)計的固相免疫分析法，快速檢測試紙利用納米金作為標記物，可在 5～10 min 完成對樣品中黃曲霉毒素的定性測定。它不需進行結(jié)合標記物與自由標記物的分離，省去了繁瑣的加樣、洗滌步驟，不僅提高了檢測速度，而且檢測過程中無需處理試劑，真正實現(xiàn)了一步式檢測［30］。
Zhang 等［31］利用一步式金標試紙法分析一個樣品，用時不到 10 min。在金標免疫試紙法的應(yīng)用過程中，孫秀蘭等［32］研究了樣品基質(zhì)對試紙條信號靈敏度的影響，為消除這些影響提供了經(jīng)驗。
鄧省亮等［33］用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標記為抗黃曲霉毒素 B1。單克隆抗體并噴于玻璃纖維上，黃曲霉毒素 B1 偶聯(lián)抗原和二抗分別結(jié)合于硝酸纖維膜上，依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維膜和吸水紙組裝切割成膠體金試紙條并裝入檢測卡中。測試結(jié)果表明，黃曲霉毒素 B1 快速檢測試紙條的靈敏度為 5 ng／mL，檢測時間為 10 min，批內(nèi)和批間重復(fù)性 100%，假陽性率和假陰性率均為 0。
6.3時間分辨熒光免疫分析法 (TRFIA)
TRFIA 是超微量檢測中一項新興檢測技術(shù)，靈敏度較放射免疫分析 (RIA) 高出 3 個數(shù)量級。TRFIA 原理與 ELISA一致，不同的是 TRFIA 采用了一種特殊的標記物，即 3 價稀土離子 (Eu3+，Tb3+等 ) 代替酶標記物或其它熒光物，用時間分辨熒光儀測定產(chǎn)物中的熒光強度，從而判斷反應(yīng)體系中分析物的濃度，達到定量分析的目的。TRFIA 利用稀土元素?zé)晒獠ㄩL與其激發(fā)波長的巨大差異克服了普通紫外－可見分光分析法中雜色光的影響，可大幅度提高分析的靈敏度。黃飚等［34］采用自制黃曲霉毒素 B1 全抗原和多克隆抗體，構(gòu)建了一套較為完整的黃曲霉毒素 B1－TRFIA 檢測平臺，具有較好的分析穩(wěn)定性，靈敏度達到 0.003 9 μg／L，線性范圍 0.003 9～100 μg／L。靈敏度和測量范圍均超越了市場上常用的進口或國產(chǎn)酶聯(lián)免疫檢測試劑 ( 分別為 0.1 μg／L 和0.1～10 μg／L)，經(jīng)過多方面考核，各項指標符合標記免疫試劑的要求，對食品、飼料等樣本檢測效果均佳，具有很好的應(yīng)用前景。
7、結(jié)語
綜上所述，黃曲霉毒素具有高的致癌、致畸性，因而受到全世界的廣泛關(guān)注。在人們對食品安全的意識不斷提高的今天，加強對黃曲霉毒素的監(jiān)控和檢測非常必要?？v觀其發(fā)展趨勢，主要有兩個發(fā)展方向，即對現(xiàn)有方法的改進和新方法的開發(fā)。常用的檢測黃曲霉毒素的方法，即薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法及高效液相色譜法，因檢測速度慢、精確度低、檢測費用高等原因而影響了對黃曲霉毒素監(jiān)控的廣泛性及檢測的即時性，需要加以改進。傳統(tǒng)檢測方法的不足促使黃曲霉毒素快速、準確檢測方法的研發(fā)，例如超光譜法，它是一種無侵入性，無損性，快速、準確檢測黃曲霉毒素的新方法，已經(jīng)使用它對花生，玉米，辣椒，堅果類等進行了黃曲霉毒素的檢測，并且準確度較高，是以后發(fā)展的方向；還有像電子鼻法、生物傳感器等方法還不完善，需要改進，未來這些方法的發(fā)展會使快速、準確、安全的檢測黃曲霉毒素成為可能。

       上海飛測生物基于全球領(lǐng)先的時間分辨熒光定量POCT檢測技術(shù)平臺，推出了黃曲霉毒素B1快速定量檢測儀和黃曲霉毒素B1熒光定量快速檢測卡，以可在10min內(nèi)快速準確定量的測定各種糧食谷物、油料作物、植物油、飼料原料及部分飼料中黃曲霉毒素B1的含量，樣品前處理簡單，操作簡便，采用熒光讀數(shù)儀讀數(shù)，結(jié)果準確可靠，適用于各類糧食、糧油、飼料加工企業(yè)、第三方檢測機構(gòu)及各級政府監(jiān)管部門。

操作視頻地址：http://v.youku.com/v_show/id_XMTcyMTU4NTMzMg==.html

1、 靈敏度：0.5ng/mL；
2、 定量線性范圍：1.0ng/mL - 50.0 ng/mL；

3、樣品前處理時間：8min；

4、檢測時間：10min；
5、準確度：添加回收率為80%-125%；
6、 特異性：在1000 ng/mL濃度水平下與其它真菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)；

二、黃曲霉毒素B1熒光定量檢測卡檢測流程示意圖   

三、黃曲霉毒素B1快速檢測儀結(jié)果判讀和輸出
      黃曲霉素B1熒光定量檢測卡采用便攜式熒光免疫分析儀進行讀數(shù)，使得檢測結(jié)果更加準確、客觀，避免人為的誤判。

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