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茶葉中真菌毒素的污染及快速定量檢測方案--8min準確定量

時間:2017-10-11來源:上海飛測點擊量:

一、真菌毒素概述

真菌毒素是某些真菌在一定環(huán)境條件下產(chǎn)生的,危害人和動物的次級毒性代謝產(chǎn)物 。迄今發(fā)現(xiàn)超過400種真菌毒素,主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、展青霉素、單端孢霉烯族毒素 中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和T-2 玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、雜色曲霉素、桔青霉素等。真菌毒素主要由曲霉屬、青霉屬、鏈格孢屬和鐮刀菌屬中產(chǎn)生。這些微生物廣泛分布在植物、土壤和空氣當中,可能污染谷物、大豆、堅果、水果、調味料、可可、咖啡、中草藥等植物性食物及其制品(如葡萄、啤酒)、飼料等。并可能在原料、加工、儲藏等環(huán)節(jié)污染食物或飼料,從而進入食物鏈 。世界糧農(nóng)組織統(tǒng)計顯示,每年全世界有25%的谷物受到真菌毒素污染,由此,美國年均損失約93.2億美元 。另外谷類和堅果中的真菌毒素可能是非洲、亞洲和南美洲消費者面臨的食品中最主要的不安全因素 。


二、茶葉中存在哪些真菌毒素

 近年來關于茶葉尤其普洱茶等經(jīng)過微生物發(fā)酵茶葉的真菌毒素污染已引起消費者的關注。茶葉是指茶樹的干燥嫩葉與嫩莖,已成為世界上除了水之外消費最多的飲料,其安全性對消費者的健康以及茶葉產(chǎn)業(yè)發(fā)展尤其重要。產(chǎn)毒真菌分布廣泛,茶園土壤和加工車間等都有可能存在,茶葉加工可能受到產(chǎn)毒真菌污染。雖然干燥環(huán)節(jié)可能殺滅紅茶、綠茶中的大多數(shù)微生物,但干燥之后如果包裝、貯藏不當,尤其茶葉吸濕受潮之后,可能受到真菌和真菌毒素污染。而普洱茶、茯磚茶等黑茶后發(fā)酵過程及產(chǎn)品中本身存在曲霉屬、青霉屬等多種真菌菌種, 也可能受真菌毒素污染 。但目前僅見印度對紅茶的黃曲霉素做了限量規(guī)定(30ug/kg)。GB2761—2017未規(guī)定茶葉制品真菌毒素限量。

            2.1. 紅茶真菌毒素相關研究

紅茶是指茶樹鮮葉經(jīng)過萎凋、揉捻、發(fā)酵、干燥等步驟生產(chǎn)出來的茶葉產(chǎn)品,是世界上產(chǎn)量最大的茶葉類別,也是除中國、日本外其他國家的主要消費品種,因此目前關于紅茶污染真菌毒素的研究報道相對較多。

早在1974年,日本學者Hitokoto等就開展了東京市售茶葉毒素產(chǎn)生菌污染的研究,從東京市售的19份紅茶樣品中,分離得到259 株泡盛曲霉,檢測發(fā)現(xiàn)這些真菌可在酵母蔗糖培養(yǎng)基上產(chǎn)生雜色曲霉素,表明紅茶受到了毒素產(chǎn)生菌的污染。Abdel-Hafez等應用薄層層析測定發(fā)現(xiàn),4份紅茶粉樣品受到黃曲霉毒素B1和B2污染,含量為2.8~2.17 mg/kg。Hasan 等從埃及市售的20個品牌紅茶粉中分離得到多株黃曲霉,檢測發(fā)現(xiàn)其中15 株可產(chǎn)黃曲霉毒素B1,B2,G1和G2,5株可產(chǎn)生黃曲霉毒素B1和B2;進一步研究發(fā)現(xiàn),茶葉接種產(chǎn)毒菌株后,可產(chǎn)生黃曲霉素,且毒素含量隨含水量增大而增加;茶葉含水量45%,28℃,培養(yǎng)20d的條件下毒素含量最大,可達26~ 81ug/kg。Elshafie 等從購于馬斯喀特的4 個品牌48份紅茶樣品中,分離鑒定出5種真菌,進一步檢測發(fā)現(xiàn)分離的25株黃曲霉均不產(chǎn)生黃曲霉毒素。Ostry等在紅茶中檢測到了可能產(chǎn)生黃曲霉素的黃曲霉菌株。Martins等測定發(fā)現(xiàn),購于里斯本的18份紅茶樣品中,有16份樣品污染了伏馬菌素B1,含量為80~280mg/kg,未檢測到伏馬菌素B2。Miraglia報道,1995-1998年歐盟國家檢測了139份紅茶樣品,其中8份樣品中赭曲霉毒素A陽性, 含量為0.03~10.3 μg/kg。Hasan發(fā)現(xiàn)接種黃曲霉菌株之后,脫咖啡因紅茶中的黃曲霉毒素是普通茶葉的5倍。R?ezác等分析發(fā)現(xiàn),布拉格市售的10個紅茶樣品受到真菌污染,但符合捷克的標準,產(chǎn)毒試驗表明分離的真菌不產(chǎn)黃曲霉毒素。Santos 等應用酶聯(lián)免疫吸附法檢測了西班牙市售的包括紅茶在內的84個藥用或芳香植物中的黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2毒素、桔青霉素和伏馬菌素,發(fā)現(xiàn)樣品普遍受到毒素污染。Mogensen 等發(fā)現(xiàn)從紅茶中分離到的Aspergillusacidus不產(chǎn)生赭曲霉毒素A、伏馬菌毒素B2 和B4。Monbaliu等建立了一個可同時測定27 種真菌毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法,檢測了91份茶葉樣品,結果只有1 份樣品檢測到伏馬菌素B1(76ug/kg)。

 研究發(fā)現(xiàn)紅茶中真菌數(shù)量及毒素含量與含水量有關,茶葉受潮后真菌會大量繁殖、產(chǎn)生毒素。真菌孢子在加工的很多環(huán)節(jié)都可能污染紅茶、綠茶等茶葉產(chǎn)品,但真菌生長及產(chǎn)生毒素需要一定的水分,如果茶葉干燥徹底、貯藏過程不受潮,即使茶葉含有真菌孢子,但不會繁殖,也不會產(chǎn)生真菌毒素。因此,對于紅茶、綠茶等茶葉加工企業(yè)來說,可以通過徹底干燥、及時包裝或真空包裝、儲存運輸過程不受潮,來降低或杜絕真菌毒素污染的風險。對于茶葉消費者來說,打開包裝之后應檢查茶葉是否霉變、開封后的茶葉必須干燥存放、勿飲用霉變茶葉,避免受到真菌毒素危害。

               2.2. 黑茶真菌毒素研究

  黑茶指制造工序為鮮葉經(jīng)殺青、揉捻、渥堆(后發(fā)酵)、干燥,成品茶呈油黑或黑褐的茶種。主要有云南普洱茶、湖南茯磚茶、四川康磚茶、廣西六堡茶等。由于獨特品質及良好的保健功效,近年來黑茶產(chǎn)量及消費量都逐漸增大。但普洱茶等黑茶加工有一個多種微生物作用的后發(fā)酵過程,這些微生物可能產(chǎn)生毒素。如普遍認為的普洱茶發(fā)酵優(yōu)勢菌黑曲霉是一般公認安全的微生物,但近年來發(fā)現(xiàn)黑曲霉的某些菌株可能產(chǎn)生赭曲霉毒素和伏馬毒素;茯磚茶的優(yōu)勢菌散囊菌屬的一些菌種也可產(chǎn)生赭曲霉毒素和伏馬毒素等真菌毒素。目前有關黑茶真菌毒素污染的風險已經(jīng)引起了廣泛的關注,部分學者開展了相關研究。

Hitokoto 等分析了共11 份茶葉樣品,其中2 份為普洱茶樣品,發(fā)現(xiàn)普洱茶真菌數(shù)量最多,優(yōu)勢菌是雜色曲霉和聚多曲霉;其中1 株雜色曲霉在小麥培養(yǎng)基上產(chǎn)生了雜色曲霉素,但在綠茶中未產(chǎn)生毒素;聚多曲霉在葡萄糖酵母和小麥培養(yǎng)基上均不產(chǎn)生毒素。陳秋娥分析了44 件臺灣市售普洱茶樣品,未檢測到黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、雜色曲霉素和桔青霉素;同時陳秋娥還研究了黃曲霉在普洱茶發(fā)酵中的產(chǎn)毒素情況,發(fā)現(xiàn)不接種黃曲霉菌株的普通發(fā)酵(對照組)和不滅菌茶葉接種黃曲霉菌株的發(fā)酵樣品均未檢出黃曲霉毒素;滅菌茶葉接種黃曲霉菌株的樣品檢出黃曲霉毒素(1.05 ug/kg),該研究表明正常的普洱茶發(fā)酵過程不會產(chǎn)生黃曲霉毒素。Abe等應用HPLC 檢測發(fā)現(xiàn),從普洱茶中分離的黑曲霉不產(chǎn)生赭曲霉毒素A和伏馬菌素。Mogensen等檢測發(fā)現(xiàn),從普洱茶樣品中分離的Aspergillusacidus不產(chǎn)生赭曲霉毒素A、伏馬菌毒素B2和B4。HOU 等檢測發(fā)現(xiàn),應用黑曲霉和炭黑曲霉(A.Carbonarius)發(fā)酵的茶葉樣品不含赭曲霉毒素A和伏馬菌素。陳建玲等隨機抽查廣州某茶葉市場濕倉儲存的普洱茶70 份樣品,發(fā)現(xiàn)其中8 份樣品(11.43%) 黃曲霉毒素B1>5μg/kg,63份樣品(90%)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇污染> 1 mg/kg,伏馬毒素(B1 和B1)和T-2 毒素毒素含量雖然都分別小于1mg/kg 和100μg/kg,但在樣品中均可檢出,應引起廣泛重視。ZHANG等應用免疫層析法檢測,并用高效液相色譜?質譜法(HPLC-MS)驗證,發(fā)現(xiàn)5 份普洱茶樣品都含有黃曲霉毒素,含量為4.9 ~59.3 μg/kg。柳其芳應用酶聯(lián)免疫測試盒測定,發(fā)現(xiàn)普洱茶黃曲霉毒素污染水平超過20 μg/kg 的有10 份(16.6%),脫氧雪腐鐮刀菌烯醇污染水平超過1000μg/ kg 的有13份(23.0%);玉米赤霉烯酮、伏馬菌素、赭曲霉毒素、T-2 毒素在樣品中均可檢出。Haas等檢測了36 份普洱茶樣品,未檢測到黃曲霉素(B1,B2,G1和G2)和伏馬菌素(B1,B2 和B3),4 份樣品檢測到赭曲霉毒素A,含量為0.65 ~ 94.7 μg/kg。趙浩軍等應用HPLC 方法檢測了市售普洱茶2 份樣品,均未檢出黃曲霉毒素B1。

   陳秋娥接種黃曲霉菌株發(fā)酵普洱茶的研究表明,正常的普洱茶發(fā)酵過程不會產(chǎn)生黃曲霉素,Abe等、Mogensen 等和HOU等3 個獨立研究都表明,普洱茶發(fā)酵過程的曲霉菌種不產(chǎn)生赭曲霉毒素A 和伏馬菌素。以上研究均表明,正常的普洱茶發(fā)酵不會產(chǎn)生真菌毒素。由于樣品及測定方法不同,關于普洱茶產(chǎn)品中真菌毒素檢測的報道不一致。陳建玲等、ZHANG 等和柳其芳檢測的普洱茶樣品較大程度受到黃曲霉毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、伏馬毒素和T-2 毒素污染;而陳秋娥 和趙浩軍等分別檢測了44和2份市售普洱茶樣品,未檢出毒素。Haas 等分析了36 份樣品的8 種真菌毒素,僅4份樣品檢測到赭曲霉毒素A。

   近年來有關黑茶的真菌毒素污染引起了廣泛關注,應加強過程控制,檢測發(fā)酵過程真菌是否產(chǎn)生毒素;篩選、應用不產(chǎn)毒素菌株發(fā)酵并監(jiān)測是否產(chǎn)毒,建立安全的黑茶發(fā)酵技術體系。

               2.3. 其他茶葉真菌毒素研究

 有關綠茶、白茶中真菌毒素的研究不多,僅Reezácˇová 等分離10 份捷克市售綠茶樣品中的真菌,發(fā)現(xiàn)均不產(chǎn)生黃曲霉毒素。Santos等檢測了西班牙市售的綠茶和白茶樣品,發(fā)現(xiàn)部分檢測樣品受到黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、T-2 毒素和桔青霉素污染。趙浩軍等檢測了2份綠茶樣品,未檢出黃曲霉毒素B1。


綜上,無論黑茶、紅茶、綠茶都可能受到真菌毒素的污染。飲用真菌毒素污染的茶葉對健康不利,但另一方面,也有大量文獻研究表明,綠茶、紅茶、普洱茶等都具有“解毒”作用,可以降低黃曲霉毒素等真菌毒素的毒性。因此今后應開展茶葉真菌毒素的風險評估研究,準確評估茶葉中真菌毒素對人體健康的風險。我國茶葉加工工藝與制品類別眾多,生產(chǎn)廠家也很多,且多數(shù)規(guī)模不大,因此更應重視茶葉可能受到毒素污染的情況。建議開展不同品種茶葉制品真菌毒素檢測研究,普查各類茶葉制品受到真菌毒素污染情況,并根據(jù)真菌毒素污染情況,制定茶葉毒素的限量指標。對于有微生物參與發(fā)酵的茶類(如黑茶),通過應用不產(chǎn)毒素菌株發(fā)酵、監(jiān)控發(fā)酵過程毒素等措施建立安全的發(fā)酵技術。我國茶葉企業(yè)與監(jiān)管機構應加強茶葉毒素的過程控制及監(jiān)測,降低茶葉受到真菌毒素污染的風險,以保障飲用安全。


三、上海飛測生物茶葉真菌毒素快速定量檢測方案--8min準確定量

上海飛測生物基于領先的熒光定量FPOCT技術平臺,率先推出了常見的六種真菌毒素熒光定量快速檢測系統(tǒng),包含真菌毒素檢測儀和真菌毒素熒光定量快速檢測試紙條,可在8min快速準確定量的檢測出茶葉中真菌毒素的殘留含量,樣品前處理簡單,檢測操作簡便,結果準確可靠且可現(xiàn)場打印,準確性符合HPLC法的檢測結果,適用于各類茶葉加工企業(yè)、第三方檢測機構及政府監(jiān)管部門。

檢測原理 

3.1. 上海飛測生物真菌毒素熒光定量檢測試紙條性能


3.2. 以檢測茶葉中的黃曲霉毒素B1為例:

黃曲霉毒素B1熒光定量快速檢測系統(tǒng)性能

 檢測靈敏度:0.5μg/kg;

 定量線性范圍:1.0μg/kg - 75.0μg/kg;

 樣品前處理時間:7min;

 檢測時間:8min;

 準確度:回收率為80%-125%;

 特異性:在1000μg/kg濃度水平下與其它真菌毒素無交叉反應;

玉米赤霉烯酮快速定量檢測試紙條

3.3. 樣品前處理過程

1、 粉碎(茶葉樣品粉碎處理);

2、 振蕩提取5min);

3、 離心(2min);

玉米赤霉烯酮快速檢測樣品前處理 

 

3.4. 檢測操作過程

1、 稀釋;

2、 加樣反應(8min);

3、 讀數(shù),打印檢測報告; 

 玉米赤霉烯酮快速檢測過程

3.5. 結果判讀和輸出

    采用便攜式黃曲霉毒素檢測儀進行讀數(shù),使得檢測結果更加準確、客觀,避免人為的誤判。

真菌毒素檢測儀

    檢測結果將呈現(xiàn)于熒光讀數(shù)儀液晶顯示屏上,同時可按打印鍵打印獲得紙質的檢測報告,另外,開通儀器的WIFI數(shù)據(jù)上傳功能后,檢測相關數(shù)據(jù)信息將自動上傳至“食品安全溯源管理云平臺”,便于溯源及質量管理。

 

3.6. 上海飛測生物真菌毒素系列熒光定量檢測試紙條產(chǎn)品亮點

上海飛測生物真菌毒素系列熒光定量檢測試紙條產(chǎn)品亮點

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