時間:2016-12-18來源:飛測生物點擊量:
摘要:對上海飛測生物科技有限公司研發(fā)生產(chǎn)的嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測試紙條在糧食谷物飼料中的檢測性能進行了評估。該產(chǎn)品的檢出限為25μg/kg,最低定量限為82μg/kg,線性范圍為100-5000μg/kg,線性范圍內(nèi)的添加回收率為83.51%~113.84%,同一個樣本的檢測3次的CV<14.75%,與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均小于5%,與其代謝物的交叉反應(yīng)率在20%以內(nèi)。該產(chǎn)品具有操作簡便、靈敏準(zhǔn)確、快速定量、重現(xiàn)性好等優(yōu)點,適合用于對糧食谷物飼料中嘔吐毒素的進行快速定量測定。
關(guān)鍵詞:嘔吐毒素快速定量檢測;熒光定量免疫層析;嘔吐毒素;糧食谷物飼料
嘔吐毒素主體成分為DON(deoxynivalenol,脫氧雪腐鐮刀菌烯醇),屬于單端孢霉烯族化合物,主要由禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、粉紅鐮刀菌、雪腐鐮刀菌等鐮刀菌產(chǎn)生。另外,頭孢菌屬、漆班菌屬、木霉屬等菌株都可產(chǎn)生該毒素。單端孢霉烯族毒素共有150多種,是一類強有力免疫抑制劑,所引起典型癥狀是采食量降低,所以這類毒素又叫飼料拒食毒素。嘔吐毒素(DON)是其中最重要一種毒素,主要來自鐮刀菌屬(Fusarium),尤其是禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)和黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum)。由于它可以引起豬的嘔吐,故又名嘔吐毒素(vomitoxin,VT)。
該毒素最早于1970年在日本香川縣的一次赤霉病大麥中毒的病毒中發(fā)現(xiàn),1972年,由日本的Morooka等首次從赤霉病大麥中分離,Yoshizawa等闡明了這種新的真菌毒素的結(jié)構(gòu),并將其命名為4-deoxynivalenol(DON)。1973年Vesonder等在美國從被鐮刀菌污染的玉米中分離出了同樣的化學(xué)物質(zhì),因為該種物質(zhì)可以引起豬產(chǎn)生嘔吐癥狀,故命名為嘔吐毒素,并相繼發(fā)現(xiàn)可以在赤霉病大麥、被鐮刀菌污染的玉米中分離出該物質(zhì)。嘔吐毒素是食品中常見的真菌毒素,在自然界中廣泛存在,通常在歐洲及北美發(fā)現(xiàn)的3種毒素是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和15-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。由于它們具有很高的細胞毒素及免疫抑制性質(zhì),因此,對人類及動物的健康構(gòu)成了威脅,特別是對免疫功能具有明顯的影響。根據(jù)DON的劑量和暴露時間不同可引起免疫抑制或免疫刺激。當(dāng)人攝入了被DON污染的食物后,會導(dǎo)致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)、反應(yīng)遲鈍等急性中毒癥狀,嚴(yán)重時損害造血系統(tǒng)造成死亡。由于中國傳統(tǒng)飲食習(xí)慣中糧谷比例大大高于西方,使得嘔吐毒素的危害更為突出。1998年,在國際癌癥研究機構(gòu)公布的評價報告中,嘔吐毒素被列為3類致癌物。歐盟要求嘔吐毒素要小于1.0mg/kg;中國谷物飼料中要求嘔吐毒素的含量低于低于1 .0mg/kg,飼料中低于5 mg/kg。
目前,國標(biāo)法測定嘔吐毒素需要大型的儀器設(shè)備,價格昂貴,操作過程復(fù)雜、時間較長,且無法在現(xiàn)場和基礎(chǔ)小型實驗室使用。除此之外,也有采用嘔吐毒素酶聯(lián)免疫試劑盒或膠體金快速檢測試紙條用于大量樣品的篩查,操作簡便,檢測快速,成本也較低,但準(zhǔn)確性和重復(fù)性較差,容易造成假陽性或者假陰性。因此,急需一種既簡便快速,又能準(zhǔn)確定量的檢測方法,熒光定量免疫層析正好可以滿足這種需求。本文通過對多種糧食谷物飼料樣品的實測,驗證了上海飛測生物開發(fā)的嘔吐毒素?zé)晒舛靠焖贆z測試紙條的技術(shù)性能。
1實驗材料和方法
1.1試劑和材料
除注明外,均為分析純,試驗用水均為UP水。
熒光熒光定量檢測試紙條(由包被有熒光微球標(biāo)記嘔吐毒素抗體的乳膠墊、噴涂有嘔吐毒素抗原的檢測線和噴涂有羊抗雞二抗的控制線的NC膜、樣品墊及吸收墊組成)、樣品提取液、樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)曲線ID卡及標(biāo)準(zhǔn)曲線條形碼均由上海飛測生物科技有限公司提供。
嘔吐毒素及其他真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品:購自Sigma公司;
大米、玉米、小麥、面粉等樣品從超市購得或從企業(yè)取樣。
麩皮,小麥、面粉等飼料樣品從飼料廠和企業(yè)取樣。
1.2儀器與設(shè)備
FD-100型熒光免疫定量分析儀和FD-5000型試紙條恒溫孵育器,上海飛測生物科技有限公司提供;低速離心機,上海盧湘儀離心機儀器有限公司;漩渦振蕩器,海門市其林貝爾儀器制造有限公司;電子天平:Sartorius;
1.3試驗方法
1.3.1樣品的前處理
取具有代表性的待測樣品500g,用小型粉碎機粉碎1min后過20目篩,收集過篩的細小樣品。稱取1.0±0.02g過篩的樣品于10mL離心管中,加入5mL提取液,用漩渦混勻儀震蕩5min(或者搖床振蕩10min)后,4000RPM離心1min,取上清。
1.3.2檢測過程
取50μL離心上清液加入500μL樣品稀釋液中,用漩渦混勻器混勻3-5s,然后取100μL加入到嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測試紙條的加樣孔中,置于37℃恒溫孵育器中溫育10min后,將試紙條插入熒光免疫定量分析儀中讀數(shù),即為樣品的實際檢測濃度。當(dāng)檢測值大于5000μg/kg時,可用提取液將離心上清液稀釋5倍后再進行檢測,所得讀數(shù)值乘以對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為最終的檢驗結(jié)果。
2檢測結(jié)果分析
2.1線性范圍與檢出限
取7個無污染(陰性)小麥樣品和7個無污染(陰性)玉米樣品,分別添加100μg/kg、250μg/kg、500μg/kg、1000μg/kg、2500μg/kg、5000μg/kg 的嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品,用上海飛測生物嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測試紙條每個樣品檢測3次,以添加濃度為為縱坐標(biāo),以熒光定量檢測試紙條的檢測結(jié)果為橫坐標(biāo),擬合曲線并計算線性相關(guān)系數(shù),結(jié)果如下:
圖1 小麥中嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品添加與熒光定量試紙條檢測值的線性關(guān)系
圖2 玉米中嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品添加與熒光定量試紙條檢測值的線性關(guān)系
計算得出小麥的線性范圍:100~5000μg/kg(6點), 回歸方程: y = 0.981x + 60.52,相關(guān)系數(shù)R2 = 0.997;玉米的線性范圍:100~5000μg/kg(6點), 回歸方程: y = 0.976x + 52.00,相關(guān)系數(shù)R2 = 0.998;(見圖1和圖2)。
取10個無污染(陰性)小麥樣品和10個無污染(陰性)玉米樣品,用上海飛測生物嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測試紙條每個樣品檢測3次,檢測限(LOD)為測定平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差,定量限(LOQ)為測定平均值加10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差。測試結(jié)果表明,DON的LOD為25μg/kg,LOQ為82μg/kg。
2.2準(zhǔn)確性和重復(fù)性分析
在用國標(biāo)法測定為0的空白樣品中分別添加嘔吐毒素總量為100,250,500,1000,2000,5000μg/kg,然后按照嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測試紙條的檢測方法進行檢測。檢測結(jié)果見表1。
表1 不同樣本檢測的準(zhǔn)確性和重復(fù)性
樣本 |
平行試驗 |
嘔吐毒素添加量(μg/kg) |
|||||
100 |
250 |
500 |
1000 |
2000 |
5000 |
||
大米 |
1 |
85.11 |
238.22 |
550.48 |
1177.61 |
2163.89 |
5389.09 |
2 |
96.24 |
292.53 |
498.09 |
996.97 |
2213.41 |
5392.65 |
|
3 |
104.88 |
287.88 |
532.44 |
1109.43 |
2290.42 |
5183.43 |
|
平均值(μg/kg) |
95.41 |
272.88 |
527.00 |
1094.67 |
2222.57 |
5321.73 |
|
平均回收率 |
95.41% |
109.15% |
105.40% |
109.47% |
111.13% |
106.43% |
|
變異系數(shù)CV |
10.39% |
11.03% |
5.05% |
8.33% |
2.87% |
2.25% |
|
玉米 |
1 |
84.91 |
206.35 |
550.71 |
1168.65 |
2312.11 |
5476.15 |
2 |
109.43 |
198.88 |
512.57 |
1046.64 |
2015.44 |
5286.45 |
|
3 |
92.02 |
221.09 |
533.23 |
1099.93 |
2175.27 |
5148.01 |
|
平均值(μg/kg) |
95.46 |
208.77 |
532.17 |
1105.07 |
2167.61 |
5303.54 |
|
平均回收率 |
95.46% |
83.51% |
106.43% |
110.51% |
108.38% |
106.07% |
|
變異系數(shù)CV |
13.22% |
5.41% |
3.59% |
5.54% |
6.85% |
3.11% |
|
小麥 |
1 |
84.91 |
239.35 |
577.71 |
1168.65 |
2312.11 |
4976.15 |
2 |
89.43 |
302.88 |
550.57 |
1146.64 |
2015.44 |
5314.45 |
|
3 |
92.02 |
282.09 |
539.23 |
1099.93 |
2175.27 |
5299.01 |
|
平均值(μg/kg) |
88.79 |
274.77 |
555.84 |
1138.40 |
2167.61 |
5196.54 |
|
平均回收率 |
88.79% |
109.91% |
111.17% |
113.84% |
108.38% |
103.93% |
|
變異系數(shù)CV |
4.05% |
11.79% |
3.56% |
3.08% |
6.85% |
3.68% |
|
面粉 |
1 |
113.13 |
287.93 |
509.07 |
940.74 |
2378.39 |
5011.52 |
2 |
118.68 |
262.21 |
566.04 |
1108.73 |
2112.45 |
5389.32 |
|
3 |
89.02 |
244.32 |
546.44 |
1137.03 |
2352.04 |
5203.04 |
|
平均值(μg/kg) |
106.94 |
264.82 |
540.52 |
1062.17 |
2280.96 |
5201.30 |
|
平均回收率 |
106.94% |
105.93% |
108.10% |
106.22% |
114.05% |
104.03% |
|
變異系數(shù)CV |
14.74% |
8.28% |
5.35% |
9.99% |
6.42% |
3.63% |
從表1可以看出,上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測試紙條測試不同糧食谷物中嘔吐毒素的添加回收率在83.51%~113.84%,3次重復(fù)的變異系數(shù)在14.75%以內(nèi)。
2.3與色譜方法的對比試驗結(jié)果
大米、小麥、玉米、面粉、麩皮、噴漿玉米、大豆、豆粕各1份共24個樣本,先采用國標(biāo)液相色譜法進行測定,再使用上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測試紙條進行測定,各測試3個平行樣。檢測結(jié)果如下:
表2 與液相色譜法結(jié)果比對(μg/kg)
樣本 |
大米 |
小麥 |
玉米 |
面粉 |
麩皮 |
噴漿玉米 |
大豆 |
豆粕 |
|
色譜值 |
1420.323 |
802.095 |
347.09 |
1890.966 |
4290.024 |
1276.420 |
2209.442 |
68.502 |
|
飛測生物值 |
1 |
1509.10 |
889.22 |
422.36 |
2099.31 |
4786.03 |
1394.44 |
2503.56 |
73.04 |
2 |
1433.43 |
948.34 |
390.02 |
2011.03 |
4603.89 |
1203.09 |
2557.48 |
63.09 |
|
3 |
1579.32 |
867.56 |
379.48 |
2133.03 |
4580.53 |
1334.04 |
2314.75 |
77.67 |
|
平均值 |
1485.54 |
876.80 |
384.74 |
2033.58 |
4565.12 |
1302.00 |
2396.31 |
70.58 |
|
符合度 |
104.59% |
109.31% |
110.85% |
107.54% |
106.41% |
102.00% |
108.46% |
103.03% |
|
CV |
4.96% |
6.89% |
8.06% |
5.32% |
4.49% |
6.27% |
6.77% |
8.84% |
表2表明,在不同的糧食谷物飼料中,上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測試紙條與液相色譜法的符合率為102.00%~110.85%,3次重復(fù)測定的的CV值在8.84%以內(nèi)。
2.4方法特異性
選擇 DON結(jié)構(gòu)類似物和其他5種真菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)品在陰性玉米中進行添加,添加的濃度為1000 μg/kg,然后用飛測生物嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測試紙條進行測試,每個樣品測3次取平均值;結(jié)果顯示與赭曲霉毒素A,伏馬菌素B1,黃曲霉毒素B1、T-2毒素、玉米赤霉烯酮交叉反應(yīng)率均<5%,與其代謝物、結(jié)構(gòu)類似物有一定的交叉反應(yīng)(<20%)。實驗結(jié)果表明,嘔吐毒素膠體金試劑條對伏馬毒素、赭曲霉毒素、黃曲霉毒素、玉米赤霉毒素幾乎無交叉反應(yīng),其方法特異性可以能滿足檢測要求。
表3 交叉反應(yīng)率表
序號 |
名稱 |
測定值 |
交叉反應(yīng)率 |
1 |
嘔吐毒素(DON) |
1124 |
100.00% |
2 |
赭曲霉毒素A (OTA) |
36 |
3.6% |
3 |
伏馬菌素B1(FB1) |
41 |
4.1% |
4 |
黃曲霉毒素B1(AFB1) |
25 |
2.5% |
5 |
玉米赤霉烯酮(ZEN) |
29 |
2.9% |
6 |
T-2毒素(T-2) |
47 |
4.7% |
7 |
3-乙?;撗跹└牭毒┐?/span> |
138 |
13.8% |
8 |
15-乙?;撗跹└牭毒┐?/span> |
165 |
16.5% |
3結(jié)論
本實驗采用上海飛測生物科技有限公司所生產(chǎn)的嘔吐毒素?zé)晒舛繖z測試紙條對不同的糧食谷物飼料樣本進行測試,該產(chǎn)品的檢出限為25μg/kg,最低定量限為82μg/kg,線性范圍為100-5000μg/kg,線性范圍內(nèi)的添加回收率為83.51%~113.84%,同一個樣本的檢測3個樣本的CV<14.75%,與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均小于5%,與其代謝物的交叉反應(yīng)率在20%以內(nèi)。其準(zhǔn)確性和可靠性均可以滿足歐盟和我國對嘔吐毒素的分析標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)要求。該方法具有簡便快速、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好等特點,可用于不同糧食谷物飼料中嘔吐毒素的快速定量檢測分析。
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