小麥?zhǔn)召?gòu)過(guò)程中嘔吐毒素檢測(cè)方法的探討

嘔吐毒素主體成分為DON（脫氧雪腐鐮刀菌烯醇），屬于單端孢霉烯族化合物，主要由禾谷鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、串珠鐮刀菌、擬枝孢鐮刀菌、粉紅鐮刀菌、雪腐鐮刀菌等鐮刀菌產(chǎn)生。由于她可以引起豬的嘔吐，故又稱(chēng)嘔吐毒素。研究表面，DON化學(xué)性能非常穩(wěn)定，一般不會(huì)在加工、儲(chǔ)存以及烹調(diào)過(guò)程中破壞，121℃高壓加熱25min僅有少量破壞，烘培溫度210℃，油煎溫度140℃或煮沸，只能破壞50%。含有嘔吐毒素谷物類(lèi)加工產(chǎn)品，在加工過(guò)程中，由于技術(shù)限制不可能完全去除，人食用含有一定量的嘔吐毒素糧油食品后，會(huì)出現(xiàn)胃部不適、眩暈、腹脹、頭痛、惡心、嘔吐，手足發(fā)麻、全身乏力、顏面潮紅、以及食物中毒性白細(xì)胞缺乏癥。嘔吐毒素主要通過(guò)胃腸道吸收，經(jīng)血液循環(huán)進(jìn)入肝臟代謝后經(jīng)腎臟隨尿液排出，造成各器官的廣泛損傷。它在人體中的半衰期為2-4h，代謝迅速，8h后就檢測(cè)不到嘔吐毒素和它的代謝物。

嘔吐毒素可在人和動(dòng)物體內(nèi)蓄積，具有致畸性、神經(jīng)毒性、胚胎毒性和免疫抑制作用。嘔吐毒素的產(chǎn)物菌株適宜在陰涼、潮濕的條件下生長(zhǎng)，廣泛存在于大麥、小麥、玉米和燕麥中。

我國(guó)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》中規(guī)定，小麥粉、小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇限量標(biāo)準(zhǔn)為1000μg/kg。

由于嘔吐毒素對(duì)人體具有較大的傷害，近年來(lái)相關(guān)部門(mén)加大了對(duì)市場(chǎng)中面粉等食品的嘔吐毒素含量檢測(cè)，在檢測(cè)中一些面粉加工企業(yè)的部分批次產(chǎn)品被檢出嘔吐毒素含量超標(biāo)，相關(guān)產(chǎn)品面粉加工企業(yè)只能回收處理，給企業(yè)造成較大的損失。而面粉中的嘔吐毒素主要來(lái)自于小麥，且在面粉加工過(guò)程中，對(duì)嘔吐毒素沒(méi)有有效的去除方法，只能通過(guò)控制小麥中的嘔吐毒素含量來(lái)保證面粉中的嘔吐毒素含量不超標(biāo)。因此面粉加工企業(yè)紛紛加強(qiáng)了對(duì)采購(gòu)小麥的嘔吐毒素含量控制。

目前對(duì)嘔吐毒素國(guó)內(nèi)常用的檢測(cè)方法主要有以下幾種：高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒、膠體金免疫層析法、熒光定量免疫層析法。

?  主要試劑與儀器

高效液相色譜儀；天平；粉碎機(jī)；移液器；免疫親和柱；甲醇；聚乙二醇。

?  嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制

臨用前將高濃度嘔吐毒素標(biāo)準(zhǔn)品，用流動(dòng)相逐步稀釋配制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

?  提取凈化

準(zhǔn)確稱(chēng)取25g均勻樣本于250ml規(guī)格三角燒瓶中，加5g聚乙二醇，加入125ml去離子水，于往復(fù)式振蕩器劇烈震蕩20min。用快速濾紙過(guò)濾，收集濾液于15ml離心管中；再將濾液經(jīng)微纖維素濾紙過(guò)濾，收集濾液于新離心管中作為上清液。取2.5ml上清液以1-2滴/s的速率將其通過(guò)免疫親和柱，直至空氣吹出柱內(nèi)的全部液體，再用10ml去離子水以1-2滴/s的速率洗滌親和柱，直至空氣吹出柱內(nèi)的全部液體。最后用2ml甲醇以1滴/s的流速淋洗親和柱，收集濾液于玻璃試管中，在50-60℃加熱條件下氮?dú)獯蹈?，然后用流?dòng)相復(fù)溶。用高效液相色譜進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)峰保留時(shí)間定性，根據(jù)峰面積外標(biāo)法定量。

?  實(shí)際操作過(guò)程的優(yōu)缺點(diǎn)

?  主要試劑與儀器

酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱、移液器、嘔吐毒素酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒

?  測(cè)定步驟

●    根據(jù)樣本檢測(cè)數(shù)插入相應(yīng)數(shù)量的酶標(biāo)板微孔于反應(yīng)板支架上，標(biāo)記好標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔，然后加入200μL左右稀釋好的洗滌液，放置1min，倒掉液體后拍干。

●    在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入50μL各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，在樣品孔中加入50μL樣品液。每孔都加入50μL稀釋后的DON抗體溶液，混合搖勻，在37℃恒溫箱中孵育60min。

●    孵育結(jié)束后甩掉微孔中的液體，然后每孔加入250μL稀釋后的洗滌液，放置1min倒掉液體，倒掉液體后用力拍干。每孔分別加入100μL稀釋后的酶標(biāo)二抗溶液，在37℃恒溫箱中孵育30min。

●    孵育結(jié)束后甩掉微孔中的液體，然后每孔加入250μL稀釋后的洗滌液，放置1min倒掉液體，倒掉液體后用力拍干。每孔分別加入50μL顯色劑和50μL反應(yīng)底物，輕輕搖勻，在37℃恒溫箱中顯色反應(yīng)15min。

●    顯色反應(yīng)結(jié)束后每孔加入50μL終止液，用酶標(biāo)儀在450nm處進(jìn)行測(cè)定（必須在加入終止液后10min內(nèi)完成測(cè)定）

●    用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品孔的光吸收值以及對(duì)應(yīng)濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，定量樣本中嘔吐毒素含量。

?  實(shí)際操作過(guò)程的優(yōu)缺點(diǎn)

?  主要試劑與儀器

粉碎機(jī)、離心機(jī)、電子天平、嘔吐毒素膠體金檢測(cè)卡、純凈水、樣本稀釋液

?  樣本前處理

●    稱(chēng)取0.5g有代表性的粉碎后的樣品，加入4ml純凈水提取。

●    用力震蕩5min，離心機(jī)4000RPM離心2min。

?  檢測(cè)步驟

●    用吸管吸取0.6ml上清液到小燒杯中，吹干濾液，然后用0.3ml體積稀釋液復(fù)溶杯底固體。

●    取出試紙，用滴管向試紙孔緩慢而準(zhǔn)確地逐滴加入3滴檢測(cè)液。

●    根據(jù)試紙上C、T線(xiàn)的顯色情況來(lái)判斷嘔吐毒素含量是否高于檢測(cè)限。

?  實(shí)際操作過(guò)程的優(yōu)缺點(diǎn)

?  主要試劑與儀器

真菌毒素?zé)晒舛靠焖贆z測(cè)箱（內(nèi)含恒溫孵育器、快速檢測(cè)儀等）、嘔吐毒素?zé)晒舛靠焖贆z測(cè)卡、嘔吐毒素樣品稀釋液、純凈水

?  樣本前處理

●    稱(chēng)取5g有代表性的粉碎后的樣品，加入25ml純凈水提取。

●    渦旋振蕩器振蕩5min，離心機(jī)4000rpm離心2min。

●    取100μl上清液加入到1000μl樣品稀釋液中配成待測(cè)液，混勻備用。

?  檢測(cè)步驟

●    將孵育器、檢測(cè)儀開(kāi)機(jī)，設(shè)定相關(guān)參數(shù)，并插入本批次產(chǎn)品ID卡。

●    取出檢測(cè)卡，水平放置于恒溫孵育器上。

●    用移液器吸取100μl待測(cè)液，加入到檢測(cè)卡的加樣孔中，計(jì)時(shí)8min孵育。

●    8min后將檢測(cè)卡插入熒光定量快速檢測(cè)儀中，按讀數(shù)鍵讀數(shù)。

●    定量檢測(cè)結(jié)果將呈現(xiàn)在快速檢測(cè)儀的顯示屏上，可準(zhǔn)確知曉嘔吐毒素含量。

?  實(shí)際操作過(guò)程的優(yōu)缺點(diǎn)

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